Молекулярная биология: Прионы и геометрия белковых тел

Когда идет речь о молекулярных основах жизни, сразу вспоминается центральная догма молекулярной биологии. В середине прошлого века шли бурные споры о химической природе наследственности, в которых сторонники белков как носителей генетической информации потерпели сокрушительное поражение.

Нуклеиновые кислоты заняли основное место в понимании законов наследственности, был раскрыт механизм их действия и воплощения в белковой форме. Центральную роль здесь играют водородные связи — именно они обеспечивают совместимость двух цепочек ДНК, перенос генетической информации от ДНК к РНК и, наконец, подбор аминокислот в соответствии с генетическим кодом для построения белковой молекулы. Реакции между белками и веществами другой природы также происходят в согласии с хорошо известными химическими принципами. Все это дало основу для развития чистого химико-физического мировоззрения в области молекулярной биологии. Стремительные практические успехи этой науки легко укладывались в рамки центральной догмы и не требовали каких-либо поправок к ней.

Однако понемногу накапливались факты, которые общепринятая догма молекулярной биологии объяснить не могла, — например, открытие прионов, чисто белковых инфекционных агентов. Эти и другие наблюдения указывают на то, что в передаче информации не последнюю роль играют геометрические формы молекул, намного более крупных, нежели азотистые основания нуклеиновых кислот.

НАПОМНИМ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Все вроде бы логично и понятно. ДНКдвухцепочечная спираль, скелетом которой служит фосфорно-дезоксирибозная нить, а смысловыми элементами — азотистые основания четырех видов: аденин, цитозин, гуанин и тимин. Химическая природа их такова, что устойчивые пары могут образовывать аденин с тимином (за счет двух водородных связей) и цитозин с гуанином (за счет трех водородных связей), а любые другие сочетания, кроме А-Т и Г-Ц, невозможны. Две водородные связи по силе идентичны одной ковалентной. Потому именно такая ориентация цепей и стабильна (рис. 1).
Центральная догма молекулярной биологииЦентральная догма молекулярной биологииРис. 1. Центральная догма молекулярной биологии. Изображение: «Химия и жизнь»

Согласно этому правилу, на одной цепи ДНК строится другая цепь — например, против последовательности ЦАГТ получается ГТЦА, причем две такие цепи (их называют комплементарными) связаны очень прочно. Так происходит репликация — размножение молекул ДНК. Если тимин заменить урацилом, а сахар дезоксирибозу — рибозой, отличающейся на одну ОН-группу, то получается РНК — она синтезируется на нити ДНК аналогичным образом. Однако новая нить ДНК почти равна по длине цепи-матрице (за исключением коротенького стартового участка), синтез же РНК стартует с определенного места и сравнительно быстро обрывается — когда кончается ген. Так происходит транскрипция, или перевод ДНК в РНК. В некоторых случаях возможна и обратная транскрипция — синтез ДНК на матрице РНК.

Добавим, что каждый отдельно взятый нуклеотид не зеркально симметричен, а значит, такова и вся цепочка ДНК или РНК: у нее различают 5' и 3'-концы. Обозначения они получили по атомам кольца рибозы или дезоксирибозы, которые участвуют в образовании связей с фосфатами. Новая цепь ДНК или РНК может строиться только в одном направлении, от 5'-конца к 3'-концу (рис. 1).

Сплайсинг РНК изымает из нее «лишние» участки, которые не должны кодировать белок. На полученной молекуле еще можно с помощью обратной транскрипции синтезировать ДНК, однако на последующих этапах возвращение к нуклеиновым кислотам уже невозможно в принципе.

Синтез белка, или трансляция, дает воплощение каждой тройке нуклеотидов в одной из 20 аминокислот, в соответствии с генетическим кодом. (Это соответствие обеспечивают молекулы транспортной РНК — тРНК.) Код вырожденный: поскольку из четырех нуклеотидов можно составить 64 разных триплета, одна и та же аминокислота обозначается несколькими триплетами. Поэтому нельзя однозначно восстановить последовательность нуклеотидов гена, зная последовательность аминокислот в белке: тут возможны варианты, и чем крупнее белок, тем больше вариантов. Намного легче идти от ДНК к белку, чем в обратном направлении, даже теоретически. И на практике тоже никаких ферментов «обратной трансляции», которые строили бы цепочки нуклеиновых кислот на матрице белка, так и не было найдено.

Вывод: все свойства живого должны быть записаны в последовательности нуклеотидов, причем информация передается от ДНК через РНК к белку и никогда — наоборот, от белка к нуклеиновым кислотам. Ни один белок не может стать самовоспроизводящейся единицей, поскольку репликация его невозможна. Ни один белок не может заставить биологическую систему сохранить свою последовательность, если она не закодирована в геноме. Все, на что способна молекула белка, — выполнить свою функцию в организме и «умереть», а хранение информации о ней — дело ДНК и РНК. Следовательно, каждый самовоспроизводящийся возбудитель болезни обязательно должен содержать нуклеиновую кислоту.

До поры до времени ученые не знали ни одного случая, когда бы эти правила нарушались. Между тем в 1949 году, в самый разгар споров о том, является ли «веществом наследственности» ДНК или белок, молодой вирусолог Даниэль Карлтон Гайдушек отправляется в Новую Гвинею с целью раскрыть причины страшного заразного заболевания, распространенного среди аборигенов племени форе. Прогрессирующее разрушение нервной системы сводило в могилу зараженного человека буквально за год после проявления первых неврологических симптомов. Папуасы форе называли этот недуг «куру» и иной причины, кроме колдовства, не видели. Гайдушек неопровержимо доказал заразность мозга погибших людей (племя куру практиковало ритуальный каннибализм). Однако болезнь характеризовалась очень долгим инкубационным периодом — от предполагаемого момента заражения до первых симптомов проходили годы.

Нуклеиновую кислоту организма-возбудителя Гайдушек выделить не сумел. Вдобавок все попытки разрушения нуклеиновых кислот в материале не уничтожали инфекционность: образцы, в которых, по идее, не должно было сохраниться ни ДНК, ни РНК, по-прежнему заражали подопытных животных.

К тому времени было известно еще несколько заболеваний со сходными симптомами, например скрепи и висна у овец, болезнь Крейцфельдта—Якоба (БКЯ) — сравнительно редкое нейродегенеративное заболевание человека. Было неясно, относится ли БКЯ к наследственным или к инфекционным болезням. С одной стороны, были описаны семьи с повышенной встречаемостью БКЯ, и даже целые этнические группы (так, у ливийских евреев она бывает в 30 раз чаще, чем у других израильтян). С другой стороны, инфекционность этой болезни была показана напрямую еще в 1968 году: инъекции экстракта мозга человека, умершего от БКЯ, в мозг шимпанзе вызывали у животных заболевание с аналогичными симптомами. Поэтому семейные и этнические случаи стали считать следствием негенетических факторов (предполагалось, например, что ливийские евреи чаще других употребляют в пищу овечий мозг).

Возбудителями этой группы болезней полагали загадочные «медленные вирусы», якобы слишком маленькие, чтобы их обнаружить, и в то же время слишком прочные, чтобы их разрушить. Смущало также и то, что у больных не наблюдалось иммунной реакции, — для заразного заболевания, мягко говоря, нетипично.

Нуклеиновые кислоты из этих «вирусов» выделить так и не удалось, и ни ультрафиолетовое излучение, ни ионизирующая радиация, ни обработка формалином не приводили к стерилизации материала. При этом обработка, разрушающая структуру белка, уменьшала инфекционность скрепи. Все это подводило к «еретической» мысли: да есть ли в этом «вирусе» нуклеиновые кислоты, не состоит ли он из чистого белка? Однако Гайдушек в своих экспериментах по заражению подопытных животных подчеркивал сохранность свойств возбудителя от заражения к заражению. Продолжительность инкубационного периода, последовательность и острота симптомов у новых жертв не менялись, что прямо указывало на необнаружимый генетический материал.

ПРИОНЫ: ОДИН БЕЛОК, МНОГО ЗАГАДОК

Работая над похожими на куру заболеваниями, такими, как скрепи у овец, коровье бешенство, болезнь Крейцфельдта—Якоба, другой исследователь, Стенли Прузинер, окончательно доказал инфекционность белка и его способность хранить информацию о природе заболевания. Он же ввел и новый термин — «прионы», образованный от первых букв английских слов proteinaceous и infectious («белковый» и «инфекционный»), который впервые появляется в статье будущего нобелевского лауреата и его соавторов, опубликованной в 1982 году. Авторы были достаточно осторожны в формулировках, они определяли прионы как белковые инфекционные частицы, устойчивые к процедурам, разрушающим нуклеиновые кислоты. Несмотря на это, статья вызвала резкую критику. В конце концов, говорили скептики, многие вирусы знамениты своей способностью выживать в самых жестких условиях, а то, что попытки выделить нуклеиновые кислоты из препарата не увенчались успехом, еще не означает, что их там действительно нет.

«В некоторых отношениях ранние этапы формирования концепции прионов повторяют историю концепции ДНК, — писал Прузинер в своей нобелевской лекции. — Перед тем как ДНК была признана веществом наследственности, многие ученые предполагали, что препараты ДНК загрязнены белком, который и является настоящим генетическим материалом».

Точно так же Прузинеру и его коллегам долго пришлось доказывать, что в прионах нет ни ДНК, ни РНК — они состоят из белка, и только из белка.

Сейчас прионный белок идентифицирован и у человека, и у многих других живых организмов. Белок этот необычен тем, что у него существуют как минимум две биологически активные структуры, или изоформы, — «нормальная» PrPC (от cellular или common) и связанная с патологией, PrPSc (от scrapie). Одна и та же аминокислотная цепочка уложена по-разному: в PrPC больше альфа-спиралей, в PrPSc больше листоподобных бета-структур. Оказалось, что патологическая структура может «заражать» нормальные молекулы, заставляя их изменять конформацию. Патогенные прионы формируют в нервных клетках агрегаты — волокна, которые и становятся причиной болезни.

Прионы видоспецифичны, то есть неодинаковы у разных биологических видов. Однако в некоторых случаях это не препятствует межвидовой передаче инфекции — человечество еще не забыло историю с «коровьим бешенством». Восприимчивыми к прионным болезням человека и сельскохозяйственных животных, на радость ученым, оказались не только шимпанзе, но также мыши и хомячки — куда более удобные модели, чем овцы и коровы. На трансгенных мышах, в клетках которых синтезировались прионные белки (это делало их более уязвимыми к инфекции), Стенли Прузинер и соавторы поставили убедительные эксперименты, развенчавшие «вирусную» гипотезу.

Резонно спросить: если прионный белок у человека один, почему прионных заболеваний много? Кроме куру и БКЯ, есть и другие, например фатальная семейная бессонница. И здесь придется вернуться к центральной догме. Предрасположенность к различным заболеваниям (или устойчивость к ним) обусловлена различными мутациями в гене белка PrP. Так, некоторые мутации вызывали синдром Герстманна—Штреусслера—Шейнкера (это нейродегенеративное заболевание иногда относят к клиническим разновидностям БКЯ), семейные случаи болезни Крейцфельдта—Якоба и семейной смертельной бессонницы. Замечалась также связь определенных мутаций прионного белка с шизофренией. Этим же объясняются и особенности «лабораторных штаммов» прионов—различия в нуклеотидных последовательностях генов у трансгенных мышей дают разнообразие свойств их прионных белков и соответственно различные картины заболеваний. (В контексте научного направления, исследующего прионы, подштаммом следует понимать вариант конформации скрепи-белка, определяющий конкретное прионное заболевание.)

Главенствующую роль прионного белка в развитии заболевания стало невозможно отрицать, после того как мышь с искусственно полученной делецией гена этого белка не удалось заразить внутримозговой инъекцией прионного материала. Правда, со временем у мутантной мыши начали развиваться нейродегенерации с нарушением координации движений, несколько похожие на прионное заболевание, но логичнее предположить, что причиной было отсутствие необходимой для организма функции здорового приона. У контрольных мутантных мышей, не получивших внутричерепную инъекцию инфекционного материала, появлялись аналогичные симптомы.

Однако многое все еще остается загадочным и необъясненным. Скептиков особенно вдохновляет то, что до сих пор никто не предложил детальный молекулярный механизм превращения клеточного прионного белка в инфекционный, не объяснил, каким образом «новичку» в точности передаются свойства штамма, за счет чего они сохраняются и образуются волокна. Так, прионный белок, вызывающий болезнь Крейцфельдта—Якоба, передает здоровому белку вариант конформационной аномалии, свойственный именно этому заболеванию, а не какому-либо иному.

С точки зрения классической молекулярной биологии неудивительно, что мутантные прионы, изменяя конформацию, функционируют иначе и становятся причиной болезни. Но почему нормальный белок от контакта с инфекционным мутантом тоже принимает патологичную конформацию и приобретает патогенные свойства?
Альтернативные формы прионного белкаРис. 2. Альтернативные формы прионного белка PrPSc, их роль в передаче свойств штамма или преодолении межвидового барьера. В верхней части рисунка — все возможные конформации PrP5', которые могут принимать прионы млекопитающих PrPC. Однако у приона каждого биологического вида есть определенный набор конформаций, которые предпочитает перенимать здоровый белок при встрече с патогеном. Прионы легко передаются между представителями одного вида, экспрессирующими одинаковые белки PrPC (а). Заражение представителя того же вида I, но с иным PrPC (б), или вида II с генетически похожим PrPC (в) возможно, если в их наборах совпадают хотя бы некоторые «опасные» конформации. Если совпадений нет, заражение вида III не происходит вовсе, либо картина заболевания оказывается иной, нежели у вида I (г). Такое перерождение приона при передаче другому виду, трудно поддающемуся заражению, называют «мутацией приона». Изображение: «Химия и жизнь»

Общая схема процесса была выдвинута еще в 90-е годы прошлого века. Подобную схему приводит в своей статье Джон Коллиндж («Science», 2010, т. З28, с. 1111). Вероятно, здоровый прионный белок может принять только ограниченное число альтернативных патологических конформаций. При этом наборы разрешенных конформаций не совпадают у разных видов и даже у разных особей (рис. 2). Если патоген представляет форму, не свойственную данному белку, этот белок он переделать не сможет, и заражения не произойдет. Здоровый белок под его влиянием либо не изменит свою конформацию, либо создаст принципиально новую конформацию, которая необязательно будет вызывать патологию. Если же нормальный белок в принципе способен образовать аномальную конформацию, которую предлагает патоген, это и происходит — развивается заражение.

Этот же автор схематично представляет и процесс размножения приона (рис. 3): сменив здоровую конформацию на патологичную, белок приобретает способность слипаться со своим «учителем», патологично сложенным белком, в единую олигомерную структуру. Образуются фибриллы, а когда они достигают определенной длины, происходит их фрагментация. Часть фрагментов становится затравкой для конверсии других здоровых прионов, остальное уничтожают протеазы организма.
Размножение прионов. Рис. 3. Размножение прионов. Взаимодействуя с патогенными прионами разных штаммов (конформаций), здоровый белок приобретает именно ту конформацию, что у приона-«учителя», а не какую-либо другую — образно говоря, быть сразу и квадратным, и треугольным невозможно. Так осуществляется передача инфекционного заболевания без участия ДНК. Изображение: «Химия и жизнь»

Таким образом, стало ясно, что не только нуклеиновые кислоты могут хранить и довольно точно передавать наследственную информацию, природа использует и другие способы. Более того: необязательно и присутствие белка.

Неожиданный результат получил в 2000 году Гайдушек («Proceedings of the National Academy of Sciences», 2000, т. 97, №7, с. 3418–3421). Он выдерживал инфекционный материал при температурах 150–1000°С в течение 5–15 минут. Было известно, что автоклавирование прионов при температуре свыше 135°С в условиях острого пара их инактивирует, однако Гайдушек все же решил проверить препарат на инфекционность, сделав внутричерепные инъекции хомякам. И произошло нечто удивительное: полностью карбонизированный при 600°С образец вызвал у хомяка симптомы болезни. После процедуры, которая должна была уничтожить все биомолекулы — и нуклеиновые кислоты, и белки, — материал по-прежнему мог заражать новые белки, сохраняя при этом особенности своего штамма. Обсуждая полученные результаты, Гайдушек с коллегами сослались на хорошо известное явление биоминерализации ископаемых одноклеточных организмов. Возможно и другое объяснение: при обугливании органических углеродсодержащих материалов образуются фуллерены от С20 до С90 — новый класс каркасных соединений с необычными физико-химическими свойствами. Эти соединения способны образовывать различные структуры, в том числе нанотрубки, внешне напоминающие амилоид. Сотрудник Гайдушека, Пол Браун, пришел к выводу, что прионы, сгорая, сохраняют свою пространственную организацию и по-прежнему остаются матрицей, которую узнает нативный белок PrPC. Эти данные заставили ученых задуматься о том, безопасен ли прах погибших от заболеваний людей и животных.

Итак, даже форма патологичного приона, повторенная углеродом или фуллеренами, может быть инфекционным агентом. Опровержений этому пока не найдено, а вот подтверждение непредвиденных возможностей геометрии молекул пришло из другой области.

«КУКЛЫ» АНТИТЕЛ

Если вдоль стены скользит предмет, имеющий определенные очертания, а в стене есть выемка, повторяющая его очертания, и ничто не мешает предмету проникнуть в нее, то легко представить, что он может задержаться в этой выемке. Именно на этом принципе основан молекулярный импринтингметод получения органических и неорганических материалов с особыми свойствами. Название метода происходит от imprinting — отпечатывание, оттиск. Молекулярно импринтированный материал создают так: в смесь мономеров добавляют вещество, для которого хотят создать «формочку», затем вызывают полимеризацию. Вокруг молекул импринтируемого вещества образуется полимер, затем это вещество вымывают или уничтожают, а в полимере остаются его отпечатки, комплементарные нужной молекуле и способные удерживать ее.

Огромный успех в создании таких полимеров был достигнут с небольшими молекулами. С крупными, такими, как белки, работать значительно труднее, однако и для них понемногу создаются подобные материалы. Одно из самых интересных направлений в этой области — импринтинг антител, то есть молекул, распознающих чужеродные для организма вещества (антигены). Совсем недавно иранский ученый Али Нематоллахзадех опубликовал статью об импринтировании антител («Angewandte Chemie International Edition», 2011, т. 50, с. 495–498), а турецкая группа во главе с Гиземом Ертюрком («Biosensors and Bioelectronics», 2011, т. 28, с. 97–104) сообщила об импринтинге того самого фрагмента антител, который связывает антигены. Понятно, что полимеры, используемые как основа, по химическому составу не имеют ничего общего ни с антигенами, ни с антителами. Удержание антител оказалось возможным главным образом из-за соответствия их геометрии и геометрии отпечатка. Водородные взаимодействия играли при этом лишь второстепенные роли.

Особого успеха добился австрийский ученый Франц Л. Диккерт, который сначала импринтировал антитела в полимерные наночастицы, а затем импринтировал сами наночастицы, осажденные на стекло, в толще полимерного материала вдавливанием («Journal of Materials Chemistry», 2011, т. 21, с. 14594–14598). В результате он получил уже не выемки, а пластиковые трехмерные копии антител, почти точно повторяющие их формы. Удивительно было то, что «куклы» антител лучше задерживали антиген (в данном опыте это был гербицид атразин), чем это делали природные антитела, привязанные к подложке. Прямые измерения подтвердили, что слой полимера со слепками активных участков антител, нанесенный на пластинку электрода, может стать основой высокочувствительного сенсора (рис. 4).
Импринтинг антител по Францу ДиккертуРис. 4. Импринтинг антител по Францу Диккерту. Антитела взаимодействуют с полимерной наночастицей и оставляют на ней отпечатки участков связывания антигенов. Наночастица, в свою очередь, отпечатывается в полимере — получается углубление с выростами, которые копируют антиген-связывающие участки. Пластиковые «куклы» антител, копирующие их геометрическую форму, вылавливают из раствора антиген еще лучше, чем белковые прототипы. Изображение: «Химия и жизнь»

Успех двойного импринтинга еще раз показал, что «неживой» материал неплохо справляется с задачами, которые, как считалось ранее, под силу только биомолекулам. Теперь перед химиками открываются обширные новые земли, о которых ранее почти никто не задумывался, — использование геометрии макромолекул.

Итак, для протекания некоторых высокоточных процессов в природе необходима именно геометрия, а не принадлежность к тому или иному классу биомолекул. Роль геометрии была доказана как созданием импринтированных материалов, так и наблюдением за свойствами прионов передавать характеристики своего штамма новым молекулам. Кстати, прионный способ передачи информации, как выяснилось, не ограничивается смертельными неврологическими заболеваниями, а широко используется в природе. Подобная передача информации была открыта у дрожжей и некоторых других грибковых организмов (С. Г. Инге-Вечтомов, «Вестник РАН», 2001, т. 70, с. 299–306). Недооцененный прежде фактор — геометрия белковых (и иных) тел — потихоньку отстаивает свое место в молекулярной биологии.