Микробиота детей

Александр Николаевич Суворов
Александр Николаевич Суворов, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург). Занимается исследованием молекулярных механизмов патогенности бактерий (в частности стрептококков) и изучением свойств пробиотиков. Лауреат премии РАМН за цикл работ по генетике стрептококков (в соавторстве с А.В. Дмитриевым, 1998).
Статья из журнала «Природа» (с. 14-21, № 8, 2011 г.)

Видовая организация микробиоты детей (в первую очередь, новорожденных) до сих пор изучена плохо. Даже в медицинской профессиональной среде бытует множество недоказанных концепций, а порой и легенд. Считается, что здоровье и состояние иммунитета младенца зависят от наличия в его организме лакто- и бифидобактерий. Если ребенок не получит их в должном количестве, то микробиота не сформируется в том виде, как ей положено, возникнет дисбиоз и не разовьется иммунитет. Однако при всей привлекательности и простоте устоявшихся представлений прямых доказательств их справедливости немного, а пока нет доказательств, научные построения остаются лишь гипотезами или даже научными мифами. Оставив в покое мифы, попытаемся разобраться, насколько современная наука продвинулась в понимании процесса формирования детской микробиоты и ее изменений с возрастом. Но для начала уточним, что считается нормальной микрофлорой человека, какие существуют подходы к оценке ее состава и функционального состояния.

СОСТАВ МИКРОБИОТЫ И ДИСБИОЗ

Организм среднего взрослого человека — естественный резервуар и источник пропитания для 3 кг бактерий. Их число, по современным представлениям, в сотни раз превосходит число наших собственных клеток, при этом знаем мы о микроорганизмах и их роли в физиологии человека постыдно мало. До самого последнего времени в сообществе врачей была распространена следующая информация: в кишечнике присутствует индигенная (резидентная) и транзиторная (случайная) микрофлора. Индигенных микроорганизмов разделяют на облигатных (главных) и факультативных, которых меньшинство. К облигатным относят бифидобактерий, бактероидов, пептострептококков, а к факультативным — лактобацилл, кишечных палочек и энтерококков. «Случайными» считаются клебсиеллы, клостридии, протеи, стафилококки, грибы рода Candida, многие из которых попадают в разряд так называемых условно патогенных микроорганизмов. У здорового человека их должно быть не более 1% от общего количества бактерий
кишечника.

На этих представлениях основаны руководства и стандарты для практикующих врачей. В частности, в ОСТ 91500.11.0004-2003 определены границы нормальных концентраций бактерий в образцах кала взрослых и детей (табл.1). Нетрудно заметить, что в стандарте предлагается оценивать количества наиболее жизнеспособных и легко культивируемых видов микроорганизмов. Объясняется это просто: только этих микроорганизмов позволяет выявлять бактериологический метод анализа, до сих пор используемый в нашей стране. Его результаты драматически расходятся с данными, получаемыми с помощью современных методов. Уже не секрет, что подавляющее большинство бактерий кишечника относятся к строгим анаэробам (они живут при полном отсутствии кислорода), поэтому образец, содержащий бактериальную биомассу, должен моментально попадать в особые, анаэробные, условия культивирования, которые непросто создать в лаборатории. Таким образом, обычно определяют лишь те виды бактерий, которые удалось вырастить, сознательно или бессознательно отметая остальные, трудно культивируемые.
Таблица 1

Совсем непонятный критерий диагностики, указанный в стандарте, — «лактобактерии». Если предположить, что этот термин равноценен английскому «lactic acids bacteria» — широкой группе молочнокислых бактерий, куда, по международной номенклатуре, входит 11 родов, в том числе стафилококки и энтерококки, тогда неясно, почему они отмечены отдельно в других графах. Если же к лактобактериям относить только лактобацилл, то почему бы не использовать это общепринятое родовое название? Правда, в таком случае из категории лактобактерий выпадут термофильные стрептококки или лактококки, столь часто используемые при изготовлении молочных продуктов.

При всех несуразностях и несоответствиях современным данным бактериологический анализ — по-прежнему основной инструмент российских клиницистов, который они используют для оценки состояния микробиоты и выявления патологий — дисбактериоза, или дисбиоза, кишечника. Это состояние характеризуется нарушением количественных и качественных показателей микробиоценоза, приводящее к негативным последствиям для здоровья. Диагностику дисбиоза в настоящее время проводят в соответствии с методическими рекомендациями Министерства здравоохранения СССР, разработанными еще в 1986 г. (табл.2). Неудивительно, что критерии определения дисбиоза вызывают много критики и в научной печати, и в Интернете: стандарты, на которые опираются врачи при постановке диагноза, устарели и не отражают в полной мере реального состояния микрофлоры кишечника и ее биоразнообразия. Связано это с ограниченными методическими возможностями бактериологической лаборатории в России.
Таблица 2
Мировая наука в настоящее время переживает необычайный всплеск интереса к нормальной микрофлоре человека. Для ее изучения созданы новые технологии, главное преимущество которых в том, что теперь нет необходимости культивировать анализируемые микроорганизмы. В отличие от бактериологического анализа методы молекулярной генетики не зависят ни от среды, ни от условий культивирования, ни от степени жизнеспособности микрофлоры. Идентифицировать вид бактерии теперь можно по специфичным нуклеотидным последовательностям. Более того, появилась возможность определять не только качественный состав и количественное соотношение микробных сообществ, но и функциональные особенности каждого вида. В будущем с диагностическим потенциалом молекулярной генетики, пожалуй, сможет поспорить лишь масс-спектрометрия, однако весьма перспективный и активно развивающийся метод «MALDI-TOF» (Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight) только в начале пути и все возможности этого метода до конца не исследованы [1].
Таблица 3
При всем разнообразии молекулярно-генетических методов для дифференцировки штаммов особую ценность представляют два подхода. Первый — анализ уникальной последовательности рибосомной РНК: обычно расшифровывают (секвенируют) ДНК-фрагмент между генами 16S и 23S РНК или просто область, кодирующую 16S, которую затем сопоставляют с последовательностями ДНК, представленными в базе данных «GenBank» на сервере Национального центра биотехнологической информации США. При втором подходе проводится анализ полного генома, основанный либо на микрочиповой гибридизации, либо на субтрактивной гибридизации, либо на реакции ПЦР в реальном времени, либо на полногеномном секвенировании [2]. Очевидно, что вторая группа исследований дает более детальную и более полную картину — она характеризует микроорганизмы, входящие в состав микробиоты, как качественно, так и количественно, однако и анализа области 16S РНК обычно достаточно для точной видовой идентификации.

К настоящему времени достоверно установлено, что истинный состав микрофлоры кишечника существенно отличается от указанного в стандартах. Больше всего в кишечнике здорового человека микроорганизмов, относящихся к двум крупным сообществам — бактероидов (Bacteroidetes) и фирмикутов (Firmicutes), каждое из которых состоит из множества родов. Бактероиды — группа анаэробных грамотрицательных бактерий трех классов (Bacteroidetes, Flavobacteria и Sphingobacteria), объединяющих множество родов и видов. Фирмикуты — преимущественно грамположительные бактерии двух основных классов (бацилл и клебсиелл). К ним относятся и хорошо знакомые бактериологам стрептококки, стафилококки, лактобациллы, энтерококки, и менее известные, но более многочисленные вейлонеллы, руминококки, эубактерии, пептострептококки (табл.3). Самые же распространенные фирмикуты — клостридии, что вступает в противоречие с показателями ОСТа (см. табл.1).
Таблица 4
Любопытно, что общее количество всех бифидобактерий, которые входят в семейство актиномицетов, обычно не превышает 5% от общего количества бактерий толстого кишечника, а лактобацилл — не более 1%. (Правда, надо учитывать, что состав микробиоты индивидуален, а приведенные значения усреднены.) Получается, существующие представления о «главных» и «сопутствующих» видах бактерий кишечника очень далеки от реальной ситуации, что привело к искаженному пониманию роли отдельных видов бактерий в работе организма в целом. Знания о микробном населении человека продолжают накапливаться. Лучше всего изучены бифидобактерии и лактобациллы, а вот о роли в физиологии человека энтерококков и кишечной палочки известно много меньше (как впрочем, и о других видах бактерий, которые, как оказалось, весьма многочисленны в кишечнике человека). Между тем состояние нашего организма всецело зависит от функциональной активности доминирующих в кишечнике видов — бактероидов, фирмикутов и протеобактерий.
Распределение микробных видов Распределение микробных видов в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека [4].

МИКРОБИОМ ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ

Задача международного проекта «Микробиом человека» (Human Microbiome Project, HMP) — расшифровать геномы микроорганизмов из различных, наиболее часто колонизируемых ими областей человеческого тела — желудочно-кишечной и мочеполовой систем, кожи, носовой и ротовой полостей [3]. Хотя работа еще далека от завершения, уже можно сделать основной вывод: микробное население человека значительно разнообразнее, чем предполагалось. В ротовой полости обнаружены бактерии более 500 видов 16 родов (Streptococcus, Actinomyces, Veillonella, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Treponema, Neisseria, Haemophilus, Eubacteria, Lactobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Leptotrichia, Peptostreptococcus, Staphylococcus). В желудке найдены бактерии 6 родов (Helicobacter, Prevotella, Lactobacillus, Veillonella, Streptococcus, Clostridium), в верхних отделах тонкой кишки — 3 родов (Lactobacillus, Streptococcus, Veillonella) и в нижних отделах — 5 (Lactobacillus, Streptococcus, Enterobacteriacae, Bacteroides, Clostridium). В толстой кишке наиболее распространены анаэробные бактерии, в общей сложности здесь обитает около 1000 видов 18 родов (Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Fusobacterium, Clostridium Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Actinomyces, Lactobacillus, Coprococcus, Faecalibacterium, Megasphaera, Veillonella, Collinsella, Eggertella, Enterobacteriacae и Enterococcus). Интересно, что по мере перехода от ротовой полости к нижним отделам кишечника происходит смена видового состава бактерий даже в пределах одного рода. Например, в ротовой полости чаще обнаруживают лактобациллу L.salivarius, в желудке — L.gasseri, а в толстом отделе кишечника — L.plantarum (табл.4). Судя по всему, некоторые виды бактерий испытывают привязанность (тропность) к определенным типам эпителиальных тканей хозяина.

По ходу пищеварительного тракта, начиная с желудка, где преобладают фирмикуты и протеобактерии, постепенно меняется не только состав миробиоты, но и количество микроорганизмов. Снижение кислотности и содержания кислорода в желудочно-кишечном тракте сопровождается возрастанием концентрации бактериальной биомассы [4]. Изучение состава микробиоты, ее изменений и взаимодействия с организмом человека необходимы прежде всего для клинической практики. Относительно недавно в медицинской литературе появился термин «синдром избыточного бактериального роста» (СИБР), который часто противопоставляется дисбиозу кишечника. Под СИБРом понимается патологическое состояние, при котором в тонкой кишке повышается концентрация бактерий до 105—106 КФЕ/мл. Однако известно, что 108 КФЕ/мл — нормальная концентрация бактерий в нижних отделах тонкой кишки. Очевидно, что в данном случае количественный (без видовой идентификации бактерий) подход не позволяет адекватно оценить клиническое состояние пациента, особенно если им оказывается новорожденный.

Пищеварительный тракт ребенка при рождении почти стерилен, но год спустя у него должна сформироваться микробиота, как у взрослого человека. Первый значимый контакт с миром микроорганизмов новорожденный испытывает при прохождении по родовым путям: проверено, что в таком случае ребенок получает микрофлору матери [8]. Кроме того, обнаружены отличия в составе, разнообразии и времени формирования постоянной кишечной микрофлоры у детей, появившихся на свет в результате кесарева сечения и родившихся естественным путем [9—11]. И все же важность того, какими были роды (естественными или искусственными), не очевидна. Например, установлено, что на составе микробиоты сказываются патологии беременности и родов [12]. Предполагают, что недоношенные и родившиеся с родовыми травмами дети, у которых, как выяснилось, снижено разнообразие бактерий, более подвержены энтероколитам. Однако прямых доказательств, указывающих на связь этого недуга с дисбактериозом кишечника у таких новорожденных, не получено.
Таблица 5
Возможно, более существенное значение для формирования микрофлоры ребенка в начале жизни имеет питание. Грудное молоко, как оказалось, нестерильно, оно содержит значительное количество микроорганизмов (стафилококков, энтерококков, энтеробактерий и др.), которые и попадают в кишечник новорожденных (табл.5) [13]. Однако влияние диеты на состав микробиоты ребенка до сих пор вызывает дискуссии, а полученные результаты порой противоречат друг другу. Одни исследователи утверждают, что при грудном вскармливании в желудочно-кишечном тракте новорожденного довольно быстро начинают доминировать бифидобактерии, а другие их либо вовсе не обнаруживают, либо находят в малых количествах. По данным одних авторов, грудное вскармливание обеспечивает не только превалирование бифидобактерий, но и понижение количества аэробных бактерий, а по данным других исследователей, такой динамики нет. И все же наиболее убедительны результаты исследований, свидетельствующие, что материнское молоко влияет на развитие детской микрофлоры: с возрастом ребенка в его кишечнике постепенно нарастает количество и меняется видовой состав бифидобактерий (табл.6) [14]. О возрастной динамике других компонентов микробиоты ребенка почти ничего не известно.
Таблица 6
При сравнении видового состава бифидобактерий у взрослых и детей выяснилось, что у взрослых доминирует B.adolescentis, а у новорожденных преобладают виды B.longum.spp. infantis и B.longum.spp.longum (табл.7) [14]. Объяснение тому нашлось после секвенированиягенома некоторых видов бифидобактерий. Оказалось, что B.longum.spp.infantis отличается от других видов бифидобактерий наличием в его геноме участка (кластера) размером в 43 тыс. пар оснований [15]. Четыре из 30 расположенных на нем генов кодируют синтез ферментов (сиалидазы, фукозидазы, N-ацетил-β-гексозаминидазы и β-галактозидазы), которые способны расщеплять олигосахариды молока до моносахаридов [16]. Вероятно, данный кластер с четырьмя дополнительными генами гликозидаз был получен в результате горизонтального переноса из другой микробной системы. Появление дополнительных ферментативных свойств у B.longum.spp.infantis сделало ее необходимым компонентом микробиома новорожденных, и неудивительно, что эта бактерия доминирует в микробной популяции бифидобактерий.
Таблица 7
Этот пример — свидетельство, с одной стороны, сложности проблемы становления микробиоты новорожденных, а с другой — отсутствия достаточной информации о значении даже отдельных ее составляющих. К настоящему моменту мы можем оперировать лишь современным объемом экспериментальных данных, стараясь критически относиться в первую очередь к методам их получения, так как даже молекулярно-генетический подход, не говоря уж о бактериологическом, не гарантирует от ошибки.
Микрофотография бифидобактерии B.longum.spp.infantisУчасток генома B.longum.spp.infantis Микрофотография бифидобактерии B.longum.spp.infantis и участок ее генома, ответственный за гидролиз олигосахаридов грудного молока [15]. Гены гликозидаз (сиалидазы, фукозидазы, N-ацетил-β-гексозаминидазы и β-галактозидазы) отмечены голубым цветом, транспортных белков — зеленым, участок инвертированного повтора — красным.

МИКРОФЛОРА И ЧЕЛОВЕК

Микробиота — неотъемлемая часть жизни и здоровья современного человека, поскольку задействована во многих процессах организма. Однако надо осознавать, что бактериям, живущим вместе с нами, надо питаться и размножаться, а не выполнять какие-то полезные для нас функции. В организме млекопитающих они получают оптимальные условия существования, доступ к широкому спектру питательных веществ и даже, что немаловажно, возможность расселяться. В ходе эволюции происходил постепенный отбор наиболее адекватных и важных для макроорганизма штаммов. Установлено, что микроорганизмы поставляют витамины, влияют на утилизацию различных сахаров, полипептидов, холестерина, минералов, а также на дезинтоксикационную и антиоксидантную функции печени и почек.
Основные функции индигенной микрофлорыОсновные функции индигенной микрофлоры в организме человека. 1 — переваривание белков, жиров и углеводов пищи и синтез летучих жирных кислот, 2 — синтез витаминов (К и В), 3 — устойчивость к колонизации патогенными бактериями, 4 — стимуляция иммунной системы.

При всей сложности и многообразии обменных механизмов, с которыми связана микробиота, следует выделить способность бактерий расщеплять те вещества, которые наш организм гидролизовать не в состоянии, и синтезировать те, которые мы сами продуцировать не можем. Так, бактерии обеспечивают питанием клетки слизистого эпителия толстого кишечника (колоноциты), вырабатывая короткоцепочечные (летучие) жирные кислоты, из которых наиболее важен бутират [17]. Кишечная микрофлора способна также синтезировать весь спектр витаминов, но, что особенно важно, производит незаменимые витамины. К примеру, только бифидобактерии могут синтезировать B1, В2, В6, В12, С, никотиновую, фолиевую кислоты и биотин.

Вполне вероятно, что эволюция микробиоты происходила в соответствии с пищевыми потребностями и особенностями диеты человека. Так, у людей из разных регионов обнаружены довольно четкие отличия в микробном составе. Например, у европейских детей доминировали фирмикуты, а разнообразие микробиоты существенно ниже, чем у африканцев, у которых преобладали бактероиды [18]. Поскольку бактероиды способны ферментировать растительные полисахариды с образованием летучих жирных кислот, которые легко усваиваются организмом человека, нетрудно предположить, что дополнительные метаболические возможности стали эволюционно важным фактором выживания человека в Африке.

Любопытно, что по сравнению с европейскими сверстниками дети из Африки в меньшей степени страдают от ожирения. Их исследовали и выяснили, что с ожирением коррелирует уменьшение биоразнообразия микробиоты. У таких детей преобладают бифидобактерии и снижено содержание бактероидов. Та же зависимость прослежена при изучении микробиоты близнецов с избыточным весом, причем по составу детская микрофлора оказалась сходной с материнской, что наводит на мысль о наличии генетической составляющей, определяющей особенности видового состава индигенных бактерий [19].

Наиболее достоверную информацию о вкладе бактерий в процессы пищеварения поставляют исследования с безмикробными организмами (гнотобионтами). Оказалось, что такие животные не только отстают в развитии и подвержены опасности погибнуть от любой сравнительно безобидной для обычных животных инфекции. У гнотобионтов не формируются ни нормальная система пищеварения, ни иммунитет, ни даже характерное для конкретного вида животных поведение, да и сама центральная нервная система. Так, у гнотобионтных мышей наблюдается гиперактивность, отсутствует чувство страха, сбиты ритмы день—ночь [20].

Бактерии играют еще и защитную роль, причем как самостоятельно, продуцируя уксусную, пропионовую и молочную кислоты (ингибиторы развития многих патогенных микроорганизмов, способных вызывать кишечные инфекции), так и взаимодействуя с системой иммунитета человека. О неполноценности иммунитета безмикробных животных хорошо известно, как и о том, что они обычно погибают от инфекций, попадая в естественную среду обитания. Установлено, что дети, выросшие в условиях с высоким уровнем гигиены, значительно чаще страдают аллергическими заболеваниями по сравнению со сверстниками, выросшими в странах, которые высоким уровнем гигиены не могут похвастаться.

Согласно «гигиенической теории», широко обсуждаемой в настоящее время, для нормального становления иммунной системы ребенку необходимо в первые годы жизни контактировать с максимальным количеством микроорганизмов, включая те, которые относят к условно патогенным. В этом могут быть полезны пробиотики, которые способствуют поляризации Т-хелперов, стимулируя про- или противовоспалительные иммунные реакции [21]. Наблюдаемые иммуномодулирующие эффекты пробиотиков, вероятно, отражают тип организации микробиоты, необходимый конкретному организму-хозяину, что обусловлено его генетическими особенностями. Иными словами, иммунитет по мере его становления «обучается» оптимальным образом взаимодействовать с микрофлорой, что позволяет макроорганизму и его микроокружению совместно решать необходимые задачи метаболизма. Формирование иммунной системы начинается еще на седьмой неделе развития плода, однако при рождении она все еще недоразвита — в первую очередь из-за отсутствия контакта с необходимым количеством микробных антигенов. Система иммунитета (и врожденного, и приобретенного) у ребенка развивается постепенно, что проявляется в изменении соотношения так называемых про- и противовоспалительных Т-лимфоцитов. При нормальном развитии ребенка это происходит параллельно с формированием микробиоты. Своевременное установление баланса Т-лимфоцитов в организме ребенка — залог нормального развития и отсутствия аллергозов в более позднем возрасте.

В заключение не лишним будет повторить, что от того, какой станет микрофлора, насколько разнообразны ее видовой состав и функциональные возможности ее компонентов, зависит развитие ребенка, начиная от скорости прибавки веса и роста и заканчивая особенностями его метаболизма, иммунитета и даже интеллекта. Очевидно, что старые представления о возрастном становлении
микрофлоры и полезности или вредности для макроорганизма тех или иных бактерий меняются и будут претерпевать изменения по мере накопления знаний. Очевидно и то, что в недалеком будущем будут обнаружены новые механизмы участия микробиоты в функционировании целостного надорганизменного консорциума, имя которому — человек.

Литература
1. Klaassens E.S, Vos W.M.de, Vaughan E.E. Metaproteomics approach to study the functionality of the microbiota in the human infant gastrointestinal tract // Applied and environmental microbiology. 2007. V.73. №4. P.1388—1392.
2. Zoetendal E., Vaughan E.E., Vos W.M.de. A microbial world within us // Molecular Microbiology. 2006. V.59. №6. P.1639—1650.
3. Nelson K.E., Weinstock G.M., Higlander S.K. et al. A Catalog of Reference Genomes from the Human Microbiome // Science. 2010. V.328. №5981. P.994—999.
4. DiBaise J. K., Zhang H., Crowell M.D. et al. Gut microbiota and its possible relationship with obesity // Mayo Clin Proc. 2008. V.83. №4. P.460—469.
5. Lцnnermark E., Friman V., Lappas G. et al. Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics // J. Clin. Gastroenterol. 2010. V.44. №2. P.106—112.
6. Matsuda K., Tsuji H., Asahara T. et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcriptionquantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V.75. №7. P.1961—1969.
7. Ahrne S., Nobaek S., Jeppsson B. et al. The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa // J. Appl. Microbiol. 1998. V.85. №1. P.88—94.
8. Mandar R., Mikelsaar M. Transmission of mother’s microflora to the newborn at birth // Biol. Neonate. 1996. V.69. P.30—35.
9. Penders J., Thijs C., Vink C. et al. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy // Pediatrics. 2006. V.118. P.511—521.
10. Neut C., Bezirtzoglou E., Romond C. et al. Bacterial colonization of the large intestine in newborns delivered by cesarean section // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1987. V.266. P.330—337.
11. Hallstrom M., Eerola E., Vuento R. et al. Effects of mode of delivery and necrotising enterocolitis on the intestinal microflora in preterm infants // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. V.23. P.463—470.
12. Schwiertz A., Gruhl B., Lobnitz M. et al. Development of the intestinal ba13cterial composition in hospitalized preterm infants in comparison with breastfed, fullt14erm infants // Pediatr. Res. 2003. V.54. P.393—399.
13. Jimйnez E., Delgado S., Maldonado A. et al. Staphylococcus epidermidis: a differential trait of the fecal microbiota of breastfed infants // BMC Microbiol. 2008. V.10. №8. P.143.
14. Lйke A., Romond M.B., Mulliй C. Insights in the human bifidobacterial flora through culture dependent and independent techniques communicating current research and educational topics and trends in applied microbiology / Ed. А.Mendez-Vilas. Formatex, 2007. P.758—765.