Невидимые миры почвы

Борис Алексеевич Бызов, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, почвовед, микробиолог. Область научных интересов — зоомикробные взаимодействия.
Яков Михайлович Рабинович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, биохимик. Занимается биоэнергетикой клеток эукариот.

^{Статья из журнала «Природа» (№ 7, 2011 г., с. 40-46)}

Мы ходим по почве, не думая, что наступаем на живые организмы: на беспозвоночных, на грибы и бактерии. Эти миры скрыты от нашего глаза и напоминают о себе лишь кучками экскрементов на поверхности. Их разнообразие огромно, и в наземных экосистемах оно сосредоточено именно в почвах — как по количеству видов, так и по их обилию и плотности. Например, в лесной почве может быть до 1000 различных беспозвоночных, а их концентрация достигает сотен видов на 1 м², сотен килограмм на 1 га. Еще больше в почвах микроорганизмов — до 1000 видов бактерий и сотен метров гиф грибов на 1 г, общая масса — несколько тонн на 1 га. Все процессы в почвах осуществляют микроорганизмы: через них проходит до 90% потоков углерода и энергии, животные же лишь регулировщики.

Животные и микроорганизмы тесно связаны друг с другом и иногда вступают в симбиоз. Микроорганизмы — главная пища многих животных, но и животные порой становятся жертвой микроорганизмов (например, хищных грибов). В почвах встречаются все типы связей как отрицательные, так и положительные: от паразитизма до мутуализма. Биологи и экологи давно поняли, что изучение межорганизменных связей чрезвычайно важно и с теоретической, и с практической точки зрения. По сути дела экология, под которой журналисты и многие обыватели понимают среду обитания человека, — это наука о взаимодействии организмов между собой и с окружающей абиотической средой. Наша цель — показать, насколько сложен и важен предмет «экология почв».

Участие организмов в экосистемах может быть прямым и косвенным. Прямое использование метаболизма в ходе химических реакций служит для получения энергии, углерода, азота, минеральных элементов. Косвенное предполагает обратную связь, когда организмы влияют на функционирование экосистем благодаря собственному присутствию и активности. Такие процессы названы регулирующими, поскольку вызывают намного большие потоки энергии и массопереноса, чем собственные метаболические потребности. Прямой вклад прямо пропорционален плотности и физиологическому состоянию организмов, а косвенный может вызываться малым воздействием, например изменением структуры почвы, влиянием на активность других организмов. Функция беспозвоночных в том и состоит, чтобы регулировать жизнь микроорганизмов. Как регулировщик, поднимая палочку, останавливает большой поток машин и, следовательно, поток энергии, а тратит на это очень мало сил, так почвенные животные регулируют жизнь микроорганизмов, а значит, и все процессы в почвах. При этом чем больше организм, тем сильнее его влияние [1].

Один из основателей экологии почв Д.Г.Звягинцев сформулировал принципы работы комплекса почвенных микроорганизмов, выделив среди них главный — дублирование функций [2]. Это можно отнести и к почвенным животным: у каждого своя роль, но они дублируются. Например, деструкцию растительных остатков осуществляют и животные, и микроорганизмы, разложение целлюлозы — грибы, фиксацию атмосферного азота — очень многие бактерии. Благодаря дублированию все процессы в почве идут постоянно, даже если какая-то группа организмов — наиболее ранимое звено в экосистеме — выбывает. Так, если в кишечнике многоножки количество симбионта, дрожжей Pichia guilliermondii, превысит естественный уровень, многоножка погибнет. Когда хищный гриб появится в среде, где много нематод, он убьет их всех, хотя и не нуждается в таком количестве пищи. Клещи, заселившие культуру грибов в чашке Петри, не остановятся, пока не уничтожат все грибы (как волки, которые режут больше овец, чем способны съесть). Итак, регуляторная роль организмов в сообществе по направлению потоков вещества и энергии намного превышает их трофическую функцию (один ест другого, его ест третий) [3].

Свойства почв и их невидимые создатели

Важнейшие для человека свойства почв — структура и плодородие, они взаимосвязаны. Создают эти свойства почвенные организмы. Большинство почв имеет свою структуру. Форма и физическая прочность почвенных агрегатов определяют аэрацию, инфильтрацию воды, водоудерживающую способность, удельную поверхность почвы. Агрегатное состояние в свою очередь обеспечивает проникновение корней растений, количество микрозон с доступными для растений питательными элементами, микробную активность, соотношение аэробных и анаэробных зон, движение микро- и мезофауны и, как следствие, плодородие почвы. Такие почвы, как черноземы, серые лесные, почти всегда плодородны, поскольку в них благоприятные условия для жизни животных и микроорганизмов, которые и создают структуру.

Копролиты (экскременты) дождевых червей — не что иное, как почвенные агрегаты. Предполагают, что почвенные частицы цементируются в пищеварительном тракте гуматами кальция при взаимодействии с бикарбонатом кальция. Стабильность копролитов объясняют также деятельностью грибов, гифы которых переплетают и связывают поверхности, или бактериальными полисахаридами, склеивающими кварц и глину. Исследуя причины механической прочности копролитов, Л.О. Карпачевский и его ученики обрабатывали их разными реагентами [4]. Выяснилось, что эти агрегаты более устойчивы к действию желудочного сока виноградной улитки Helix pomatia, чем комковатые и зернистые. Известно, что улиточный сок содержит ферменты, растворяющие клеточные стенки микроорганизмов. Значит, копролиты червей содержат больше веществ микробного происхождения и микробных клеток, разрушаемых ферментами.

Таким образом, структура почв определяется взаимодействием беспозвоночных и микроорганизмов. Резонный вопрос, а каков же масштаб этих процессов? Подсчитано, что в почвах умеренной зоны за сезон дождевые черви образуют 75—250 т/га копролитов. За 50—100 лет через их пищеварительный тракт пропускаются верхние горизонты пахотных почв [5]. Казалось бы, работа червей невелика, но она постоянна, ее результаты накапливаются в почве, и в этом их регулирующая роль.

Животные влияют на почвенное плодородие, модифицируя состав питательных элементов при гибели, экскреции продуктов жизнедеятельности, измельчении и перемешивании органических и неорганических частиц, изменении микробиологической активности. В почвах Центральной Европы за счет гибели дождевых червей выход азота достигает 24 г/м², что сопоставимо с ежегодной дозой минеральных азотных удобрений (100—200 кг N на 1 га). Биомасса дождевых червей, содержащая 65—75% белка, в почве быстро разлагается, но азот вымывается не так быстро, поскольку связывается микроорганизмами.

Черви выделяют неорганические и органические вещества, в том числе физиологически активные. Основной конечный продукт азотного обмена — мочевина — гидролизуется до аммония, а слизистые выделения состоят из мукопротеинов. В лабораторных опытах показано, что ежедневно черви выделяют 88—270 мг N на 1 кг биомассы (ежегодно 18—60 кг N на 1 га). Через популяции дождевых червей проходит около 40% всего азота, ежегодно поглощаемого растениями.

Копролиты червей, а также стенки ходов имеют более высокое значение pH, чем окружающая почва. Ходы с разветвленной структурой достигают глубины более 1 м, занимают по длине сотни метров, по ним распространяются корни растений. Некоторые виды, например Lumbricus spp., экскретируют кальциевые сферулы, образующиеся в кальциевых железах и в просвете кишечника. Некоторые черви способны оптимизировать pH в местообитаниях, что позволяет им колонизировать кислые почвы.

Благодаря перемещению почвы, увеличению аэрированности и дренажа, дезинтеграции и инкорпорации подстилки черви влияют на дифференциацию почвенного профиля, модифицируя физико-химические свойства почв и расширяя круг биологически активных зон. Ускоренные при этом процессы минерализации, гумификации и выветривания увеличивают оборот питательных элементов и, как следствие, плодородие почвы и продукцию растений. В Новой Зеландии сведение лесов под пастбища снизило продуктивность экосистемы и привело к накоплению на поверхности слоя экскрементов крупного рогатого скота и овец, поскольку из-за интенсивной обработки почти не осталось червей. Когда в 1950 г. на отдельные участки интродуцировали червей Aporrectodea caliginosa, слой навоза через несколько лет исчез, и физические свойства почвы улучшились [6]. Биомасса червей используется в качестве добавок к кормам в животноводстве, в рыбоводческих хозяйствах [7].

Давно известно, что почва, заселенная червями, плодороднее бедной ими. В 50-х годах прошлого столетия червей (Eisenia fetida, красный Калифорнийский гибрид) начали разводить в промышленном масштабе для утилизации органических отходов (пищевых и других бытовых, сельскохозяйственных, промышленных), для получения высокоэффективного удобрения (биогумуса). Почему? Черви создают в отходах структуру, подобную почвенной, убивают семена многих сорняков и патогенные организмы, очищают съеденный субстрат от тяжелых металлов и пестицидов, образуют физиологически активные вещества, благоприятные для растений. За счет формирования агрегатов они аэрируют субстрат, снижая концентрацию газообразных продуктов анаэробиозиса, накапливают нитратный азот, усваивающийся растениями [8]. Черви способствуют переводу химических элементов (азота, кальция и калия) в доступную для растений форму: в копролитах их больше, чем в исходном пищевом субстрате. Время жизни питательных элементов в биогумусах в шесть раз дольше (до 30 сут), чем в окультуренных почвах, а плодородие примерно в пять раз выше [9]. Накопление в копролитах гумусовых веществ, очевидно, связано с биохимической трансформацией органических веществ в пищеварительном тракте микроорганизмами. Итак, плодородие почвы регулируют животные, но основные исполнители — бактерии и грибы.

Взаимодействие беспозвоночных и микроорганизмов

Роль беспозвоночных в почвообразовании во многом связана с регуляцией состава и активности микроорганизмов. Обратим внимание на селективное потребление животными микробов и на те события, которые происходят с микроорганизмами в пищеварительном тракте. Одна из фундаментальных закономерностей — изменение в соотношении мицелиальных грибов/бактерий: в почве бактерий становится больше, а грибов меньше. Беспозвоночные предпочитают в основном грибы. Однако не все группы, виды и даже штаммы микроорганизмов, попав в кишечник животного, ведут себя одинаково. С ними могут происходить разные события: гибель популяции (например, дрожжевых грибов), подавление роста, сохранение жизнеспособности, инициация прорастания спор, размножение. Животные почему-то предпочитают в пищу грибы, содержащие в гифах темный пигмент меланин. При оценке микробного загрязнения почв необходимо помнить, что генетически модифицированные человеком бактерии могут размножаться и даже передавать генетическую информацию диким бактериям в кишечнике [10], а возможно, и получать от почвенных бактерий новые гены, например устойчивости к антибиотика. Наш тезис — у каждого животного есть свой круг микробов-жертв. В этом и проявляется функциональное биологическое разнообразие — в трофических сетях животные не стоят в очереди за пищей, а каждый имеет свою, согласно со способностями переварить ее.

Для объяснения причин избирательной гибели микроорганизмов в кишечнике животных мы проверили активность пищеварительных экстрактов некоторых беспозвоночных (многоножек-кивсяков, мокриц, виноградной улитки). Получили предсказуемый результат: часть микроорганизмов гибнет, другие не чувствительны, беспозвоночные отличаются разной антимикробной активностью [10]. Позже такую киллерную активность обнаружили и у дождевых червей [11]. Под действием кишечной жидкости быстро, в течение нескольких минут, подавляется дыхание — гибнут клетки [12]. Чувствительные к перевариванию клетки изменяются в облике уже через несколько секунд. В просвечивающем электронном микроскопе видно, что под действием кишечной жидкости многоножки кивсяка Pachyiulus flavipes цитоплазма дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae становится гранулированной, исчезают ядро, митохондрии, вакуоли (рис.1). Большинство клеток сохраняют целостность и клеточную стенку. Изменения внутриклеточной организации позволяет говорить о мембранотропном действии веществ кишечной жидкости [8].

Чувствительны к киллерной активности, как правило, обитатели листового опада или почвы, а устойчивы обитатели кишечника и экскрементов животных, что говорит об их адаптации к кишечной среде животного. Киллерные агенты имеют небелковую природу. Среди них обнаружено новое вещество —16-сульфо-гидроксипальмитиновая кислота: –SO₃-O-(CH₂)₁₅-COOH, имеющая свойство умеренного детергента.

Рис.1. Гибель клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae под действием пищеварительной жидкости кивсяка (увел. 400). Снизу — контроль (увел. 900).

Скорость и степень разрушения клеток под действием пищеварительной жидкости мы исследовали по выходу в водный раствор ₁₄С — меченых органических соединений. После нескольких минут пребывания в этой активной среде клетки теряют до 80% своего содержимого, причем киллерная фракция, хотя и не содержит ферментов, тоже вызывает лизис. Механизм такого переваривания микроорганизмов представляется нам следующим образом. Чувствительные микробные клетки быстро гибнут под действием киллерных веществ: они нарушают барьер проницаемости, и в раствор выходит часть содержимого цитоплазмы (рис.2). Гидролиз клеточного материала осуществляют вместе автолитические ферменты микробной клетки и ферменты животного. Каждый вид животного, очевидно, имеет свой круг микробов-жертв — благодаря различному составу киллерных веществ.
Рис.2. Гипотетический механизм киллерного действия на клеточную мембрану.

Предложенный нами механизм сходен с описанным для позвоночных индуцированным автолизом: жертва обеспечивает собственное переваривание, индуцируемое веществами пищеварительного тракта хищника. При этом живые организмы перевариваются эффективнее мертвых. Известно, что состав автолитических ферментов любой клетки более широк, чем спектр пищеварительных ферментов животного, — это модель «искусственного удава» [12]. Причина селективности переваривания до сих пор не ясна. Возможно, киллерные вещества специфически взаимодействуют с мембранными фосфолипидами и, подобно детергентам, вызывают деструкцию мембран. Участие жирных кислот в переваривании микроорганизмов животными до сих пор не отмечалось. Индуцированный автолиз, видимо, существует и у других беспозвоночных — насекомых, нематод. Многие хищные насекомые парализуют и убивают жертву ядами, а переваривание происходит вне кишечника (внекишечное пищеварение) аналогично индуцированному автолизу. Значит, пищеварительный тракт беспозвоночного можно представить как селективный «фильтр» и одновременно как ферментер для микроорганизмов (рис.3).
Рис.3. Пищеварительный тракт беспозвоночных как фильтр и ферментер.

У всех позвоночных есть кишечные симбионты. Их значение в жизни макроорганизма огромно, и нарушения их функций (дисбиозы) приводят к сбою в работе организма. Наличие симбионтов у почвенных беспозвоночных пока строго не доказано. Здесь необходим не только поиск новых, не встречающихся в почве видов бактерий и грибов, но и выявление у них специальных функций симбионта, важных для жизни хозяина. Наиболее весомый знак — микроорганизмы прикреплены к стенкам кишечника. Так, у дождевых червей гифы актиномицетов врастают в стенку [13]. Мы показали, что в кишечнике почвенных многоножек живет множество разнообразных бактерий: от очень мелких (менее 0.2 мкм) кокков до длинных палочек (рис.4). Бактерии, выделенные из червей, на 80—90% представлены факультативно-анаэробными штаммами [14]. В кишечнике дождевых червей обнаружены новые представители семейств Sphingomonadaceae (Alphaproteobacteria), а также Alcaligenes spp. (Betaproteobacteria). Они живут и в почве, но, когда попадают в кишечник червей, их становится больше [15].

Пищеварительный тракт беспозвоночных можно рассматривать как анаэробную зону в почве, в которой бактерии осуществляют денитрификацию, диссимиляцию нитратов и детоксификацию нитритов [16]; там активнее фиксируется атмосферный азот [17], а потребляемые микроорганизмы снабжают организм хозяина белком, незаменимыми аминокислотами и жирными кислотами [18]. Такие микроорганизмы способны продуцировать гидролитические ферменты, целлюлазы и хитиназы. Кишечные актиномицеты в сравнении с почвенными обладают повышенной антибиотической активностью, что, возможно, служит беспозвоночным защитой от внешних врагов [19].
Рис.4. Бактерии, ассоциированные с кишечником кивсяков.

Большинство кишечных микроорганизмов хорошо переносят недостаток O₂; у них при ассимиляции органических соединений преобладают простые углеводы; растут они быстрее почвенных; так же, как почвенные, могут расти на гуминовых кислотах. У дождевых червей обнаружены и микроскопические мицелиальные грибы. Экскреты червей обладают биологической активностью, действуя в очень низких концентрациях (мкг/мл) на рост бактерий, подавляя одних и стимулируя других [20]. Наконец, гуминовые кислоты, потребляемые червями, приобретают иную биологическую активность по отношению к бактериям и грибам за счет биохимической трансформации в кишечнике [21].

Все эти факты вместе с новыми сведениями о функциях кишечных микроорганизмов, которые неизбежно появятся в ближайшее время, позволят составить функциональный «портрет» микробного сообщества пищеварительного тракта беспозвоночных и доказать их симбиотическую роль.

Сейчас мы можем утверждать, что сами взаимодействия несут функции, отличные от функций отдельных организмов. Их можно даже назвать биосферными функциями (рис.5).
Рис.5. Биосферные функции зоомикробных взаимодействий в почвах.

Мы видим, что связи почвенных беспозвоночных и микроорганизмов огромны, а их функции разнообразны. Здесь мы коснулись лишь нескольких. Уверены, что найдутся энтузиасты, которые займутся новыми вопросами этой обширной темы. Возможно, наиболее плодотворны будут поиски новых микробных симбионтов и познание эволюции симбиотических взаимоотношений на червях как наиболее древних почвенных беспозвоночных. Новые молекулярно-биологические методы дают возможность это делать. Работы по расшифровке селективного переваривания и киллерного воздействия пищеварительной среды животных приведут не только к новым находкам природных соединений с антимикробными свойствами, но и к расшифровке молекулярных механизмов межорганизменных взаимодействий. Изучение симбионтного пищеварения и питания важно не только для понимания механизмов коэволюции трофических взаимодействий микроорганизмов и животных. Оно поможет искать новые источники биологически активных веществ (ферментов, аминокислот, витаминов). Наконец, антибиотические взаимодействия, особенно сильно проявляющиеся в кишечнике животных, — стимул к направленному поиску микробов — продуцентов новых антибиотиков.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Проект 10-04-22519.

Литература

1. Anderson J.M. Soil organisms as engineers: microsite modulation of macroscale processes // Linking Species and Ecosystems. Eds C.J.Jones, J.H.Lawton. N.Y., 1995. P.94—106.
2. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М., 1987.
3. Anderson J.M. Ecology of Microbial Communities / Ed. M.Fletcher. Cambridge, 1987. P.125—133.
4. Манаенков И.В., Зубкова Т.А., Карпачевский Л.О. Механическая прочность почвенных агрегатов разной формы // Почвоведение. 1997. №12. С.1438—1444.
5. Makeschin F. Earthworms (Lumbricidae: Oligochaeta): Important promoters of soil development and soil fertility. Fauna in soil ecosystems. Recycling processes, nutrient fluxes and agricultural production / Ed. G.Benckiser. 1997. P.173—223.
6. Lee K.E. Earthworms. Their Ecology and Relationships with Soils and Land Use. Sydney; Orlando; San Diego; N.Y.; L.; Toronto; Montreal; Tokyo, 1985.
7. Ferruzzi K. Manuale del Lombricontrole. Bologna, 1984.
8. Тиунов А.В. Влияние дождевых червей Nicodrilus caliginosus на нитрификацию в дерново-подзолистых почвах. Деструкция органического вещества в почве. Вильнюс, 1989. С.172—176.
9. Edwards C.A., Fletcher K.E. Interactions between earthworms and microorganisms in organic matter breakdown // Agriculture, Ecosystem and Environment. 1988. V.24. №1—3. P.235—247.
10. Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. М., 2005.
11. Хомяков Н.В. Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы. Авотореф. дисс. … канд. биол. наук. 2009.
12. Уголев А.М., Цветкова В.А. Индуцированный автолиз как важный механизм начальных стадий пищеварения в естественных условиях // Физиологический журнал СССР им.И.М.Сеченова. 1984. Т.70. №11. С.1542—1550.
13. Jolly J.M., Lappin Scott H.M., Anderson J.M., Clegg C.D. Scanning electron microscopy of the gut microflora of two earthworms: Lumbricus terrestris and Octolasion cyaneum // Microbiol. Ecol. 1993. V.26. P.235—245.
14. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т.65. №1. С.102—110.
15. Nechitaylo T.Y., Yakimov M.M., Godinho M. et al. Effect of the earthworms Lumbricus terrestris and Aporrectodea caliginosa on bacterial diversity in soil // Microbial Ecology. 2010. V.59. №3. P. 574—587.
16. Karsten G.R., Drake H.L. Comparative assessment of the aerobic and anaerobic microfloras of earthworms’ guts and forest soils // Appl. Envir. Microbiol. 1995. V.61. №3. P.1039—1044.
17. Citernesi V., Neglia R., Serriti A. et al. Nitrogen fixation in the gastroenteric cavity of soil animals // Soil Biol. Biochem. 1977. P.71—72.
18. Pokarzhevskii A.D., Zaboev D.P., Ganin G.N., Gordienko S.A. Amino acids in earthworms: are earthworms ecosystemivorous? // Soil Biol. Biochem. 1997. V.29. №3/4. P.559—567.
19. Нгуен Дык Т.Л., Бызов Б.А., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Антагонистические свойства актиномицетов, ассоциированных с пищеварительным трактом почвенных беспозвоночных // Вестн. Моск. ун&та. Сер.17. Почвовед. 1996. №3. С.70—77.
20. Олейник А.С., Бызов Б.А. Реакция бактерий на воздействие поверхностных экскретов дождевых червей // Микробиология. 2008. Т.77. №6. С.854—862.
21. Тихонов В.В., Бызов Б.А., Завгородняя Ю.А., Демин В.В. Дождевые черви — преобразователи структуры и биологической активности гуминовых веществ // Известия РАН. Сер. биол. 2010. №8. С.1—11.