Липидный фундамент жизни

Статья из журнала «Природа» (№ 3, 2012 г., с. 3 – 12, © Чугунов А.О., Полянский А.А., Ефремов Р.Г.).
Роман Гербертович ЕфремовРоман Гербертович Ефремов, доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией моделирования биомолекулярных систем и заместитель директора Института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Занимается изучением биологических мембран, теоретическим моделированием структуры и динамики мембранных белков.
Антон Олегович ЧугуновАнтон Олегович Чугунов, кандидат физико-математических наук, научный сотрудник той же лаборатории. Область научных интересов — образование пространственной структуры (фолдинг) белка, мембранные рецепторы, моделирование структуры рецепторов, действующих через активацию G-белка (GPCR).
Антон Александрович Полянский Антон Александрович Полянский — кандидат физико-математических наук, научный сотрудник той же лаборатории. Область научных интересов — физика белка, молекулярная организация мембран, направленная разработка лекарств. Вместе с А.О.Чугуновым создал научно-популярный сайт «Биомолекула» (http://biomolecula.ru).

Зарождение жизни на Земле — вопрос, на который пока нет окончательного ответа, но мало кто сомневается, что ее возникновение стало возможным лишь в тот момент, когда в «первичном бульоне» стали появляться маленькие изолированные области пространства, ставшие основной ареной для эволюции. В этих «первичных клетках» биохимические процессы могли протекать существенно быстрее, нежели на безбрежных просторах океана, и это послужило одной из предпосылок для первых, добиологических, шагов эволюции. Именно компартментализация (от англ. compartment — отсек, отделение) — один из обязательных признаков жизни.

Структурообразующую функцию биологических мембран выполняют липиды — амфифильные молекулы, имеющие полярную головку и неполярный (гидрофобный) хвост. Они малорастворимы в воде и склонны к образованию моно- и бимолекулярных слоев благодаря своей амфифильной природе.

Любопытно, что среди первых исследователей свойств липидов оказался один из отцов основателей США Б.Франклин. В 1773 г. он измерял площадь масляных пятен на поверхности пруда, остающихся от ложки (5 мл) растекающегося оливкового масла: пятна неизменно оказывались размером ≈2000 м2. (Зная это, несложно оценить и толщину мономолекулярного слоя: разделив объем ложки на площадь пятна, получим 2.5 нм*).

* Если бы Франклин имел представление о молекулярном строении вещества, он легко мог бы вычислить и площадь одной молекулы триглицерида олеиновой кислоты (основного компонента оливкового масла) в этом мономолекулярном пятне, причем довольно точно: Sмол = Sпятна * Mr / (NA *Vложки масла), где Mr — масcа 1 моля триолеина, NA — число Авогадро, Sпятна — площадь пятна, Vложки — объем ложки, рмасла — плотность масла. В результате получатся, что площадь молекулы ≈1 нм2.

Более 100 лет спустя Ч. Овертон заметил, что через биомембраны сравнительно легко проникают вещества, хорошо растворимые в липидах. Из этого он сделал заключение, что мембрана должна быть образована тонким липидным слоем. Так эксперименты Франклина оказались впереди современных биофизических изысканий. 1925-м годом датируется идея бислойности мембраны: Э. Гортер и Ф. Грендель обнаружили, что монослой липидов, выделенных из мембран эритроцитов, ровно вдвое превосходит площадь поверхности самих клеток.

Однако тогда же было замечено, что мембрана содержит значительное количество белков, которые сильно влияют на ее свойства (в частности, поверхностное натяжение). Это открытие повлекло появление в 1935 г. концепции мембраны «сэндвича»: Х. Доусон и Дж. Доннелли образно сравнили липидный бислой, заключенный между двумя слоями белка, со слоем масла в бутерброде. Прошло не одно десятилетие, пока точные данные по соотношению белков и липидов в мембранах различных клеток и современные методы исследования (такие как рентгеноструктурный анализ и электронная микроскопия) не доказали ошибочность этого представления: на самом деле белки не окружают бислой — они в него «встроены», подобно элементам мозаики. Эта метафора дала название теории «жидкостно-мозаичного» строения мембраны: мембрана — своего рода липидный «океан», в котором, как айсберги, плавают молекулы белков [1]. Сравнение с океаном появилось не случайно — липиды в мембране находятся в жидком (точнее, в жидкокристаллическом) состоянии. Хотя эта теория Сингера—Николсона явно устарела, ее зачастую называют классической, ведь современные представления еще не достигли той лаконичной изящности, чтобы их начала запросто можно было изложить в школьном учебнике [2].

Мембрана сравнительно свободно «течет» в плоскости, в то время как вне ее — строго упорядочена геометрией двойного молекулярного слоя. Текучесть липидной фазы мембраны обусловлена присутствием в углеводородных цепях большинства структурных фосфолипидов минимум одной ненасыщенной связи, понижающей температуру плавления липида. Проследить такое фазовое поведение достаточно просто на примере растительного масла и маргарина. При комнатной температуре растительное масло жидкое, так как содержит ненасыщенные жирные кислоты, в частности триолеин, температура плавления которого составляет 5°C. Маргарин же — твердый, поскольку получают его из растительного масла гидрированием, а у образующегося в результате насыщенного жира стеарина Tплавления = 55°C. Полиненасыщенные жирные кислоты (в изобилии присутствующие в рыбьем жире) обладают еще более уникальными свойствами: они поддерживают липидный матрикс мембран в «рабочем» состоянии в широком диапазоне температур, что позволяет рыбам быстро погружаться в холодные слои и всплывать обратно. Кстати, эти уникальные качества полиненасыщенных жирных кислот полезны и для человека.

В настоящее время стало понятно, что липиды мембраны — не просто пассивные носители белков, а равноправные участники большинства биохимических процессов. На поверку оказывается, что липидный состав тщательно оптимизирован эволюцией и позволяет создать необходимые условия для корректной и эффективной работы мембранных белков. Например, при частичном несмешивании липидных компонентов мембраны эукариотической клетки появляются наноскопические неоднородности — так называемые мембранные рафты (от англ. raft — плот). По-видимому, они образуют функциональные платформы, в которых комплексы мембранных белков выполняют все разнообразие своих функций.

Каковы же современные представления о биофизике липидов биологических мембран и, в частности, о способности липидов к самоорганизации, которая широко используется клетками в своих нуждах?

МНОГООБРАЗИЕ БИОМЕМБРАН

Неудивительно, что мембраны клеток разных организмов отличаются между собой, и эти различия носят принципиальный характер: помимо «населяющих» эту мембрану белков функции той или иной мембраны определяет ее «липидный портрет» [3]. Так, мембраны бактерий и эукариот отличаются тем, что в состав первых входит большое количество отрицательно заряженных фосфолипидов (например, фосфатидилглицеролы), тогда как вторые в основном содержат липиды цвиттерионной природы (которые, обладая как отрицательным, так и положительным зарядом, в целом электронейтральны) — например, фосфатидилхолины (рис.1). Это фундаментальное отличие используется системой врожденного иммунитета многих эукариот — например, антимикробные пептиды селективно разрушают мембраны бактерий именно благодаря наличию отрицательного заряда на их поверхности (подробнее см.: Чугунов А.О., Ефремов Р.Г. Компьютерные игры в молекулярную биофизику // Природа. 2010. №12. С.36—43).

Другая важная особенность мембран эукариот — холестерол (он же — холестерин), отсутствующий у прокариот. Вопреки дурной славе у обывателей, холестерол играет важнейшую и еще, видимо, не до конца понятую роль в работе мембран наших клеток (не говоря уже о том, что он — предшественник половых гормонов). Вместе со сфингомиелином холестерол образует рафтовые структуры, придающую эукариотическим мембранам прочность и особую функциональную гетерогенность.

Липидный состав разных органелл существенно различается (рис.2). Например, у митохондрий и пластид он гораздо больше напоминает бактериальный, нежели эукариотический, подтверждая тем самым химерную гипотезу становления эукариот, согласно которой эти органеллы — бывшие бактерии, захваченные в плен путем фагоцитоза какими-то ранними формами эукариот [4]. В эндоплазматическом ретикулуме — «стартовой точке» метаболизма большинства липидов — состав обоих листков мембраны примерно одинаков, однако в аппарате Гольджи, плазматической мембране и эндосомах различия уже весьма существенны, что говорит о наличии активных процессов, создающих эту асимметрию. В частности, фосфатидилсерины (ФС) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ) в норме присутствуют только в цитоплазматическом листке плазматической мембраны. Наличие ФС на поверхности клетки может говорить о злокачественном перерождении и запускает программы фагоцитоза и сворачивания крови.
Основные типы липидовРис.1. Основные типы липидов, встречающихся в биологических мембранах. Разнообразие (до 1000 разновидностей) липидов обеспечивается сочетанием разных гидрофобных, гидрофильных и «адапторных» фрагментов.
Липидный состав Рис.2. Липидный состав различных мембранных структур клеток млекопитающих [3]. На диаграммах содержание холестерола (ХОЛ) дано в отношении к суммарному количеству фосфолипидов (ФЛ). Внутри клетки обозначены места синтеза основных фосфолипидов (голубые овалы) и сигнальных липидов (красные овалы). В эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) синтезируются в основном глицерофосфолипиды, жиры, холестерол и церамиды. Аппарат Гольджи — «поставщик» сфингомиелина и сложных гликосфинголипидов. Около половины липидов митохондрий — в основном фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидной кислоты (ФК) и кардиолипина (КЛ) — синтезируется этими органеллами автономно.

Совершенно уникальной организацией мембран обладают (наряду с бактериями и эукариотами) архебактерии — третий «домен» жизни. Эволюционно они считаются более близкими родственниками эукариот, нежели бактерий, хотя по строению липидов мембраны этого не скажешь [5]. Видимо, в качестве адаптации к экстремофильности (способности обитать при высоких температуре, и/или солености, и/или кислотности), мембраны архей содержат липиды с нетипичным химическим строением (см. рис.1):
— конфигурация остатка глицерола иная;
— неполярные «хвосты» прикрепляются к этому остатку не сложными, а простыми эфирными связями;
— хвосты имеют не линейную структуру, а состоят из изопреновых звеньев, и, что самое интересное, архейные липиды могут быть биполярными («сшитыми» кончиками и пронизывающими всю мембрану насквозь) и содержать для большей прочности циклопентановые кольца, предположительно выполняющие функцию двойных связей в «обычных» фосфолипидах (регулирование температуры плавления).

Из всего сказанного следует, что липидный состав мембран отнюдь не является чем-то выбранным раз и навсегда [6]: он претерпел существенные изменения в процессе эволюции. По всей видимости, липидную организацию мембран эукариот можно считать эволюционно наиболее прогрессивной, поскольку она обеспечивает максимально гибкую адаптацию микроскопического окружения под нужды белковых молекул, создавая частично изолированные области в пределах одной, казалось бы, жидкой фазы.

ЛАТЕРАЛЬНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ

Что же заставило исследователей усомниться в модели Сингера—Николсона и предположить, что мембрана — это нечто более сложно устроенное, нежели липидный «океан», в котором плавают «айсберги» белков?

Во-первых, в каждой эукариотической клетке присутствует более 1000 разновидностей липидов — такое разнообразие обеспечивается комбинацией различных полярных «головок» и гидрофобных «хвостов» [7]. Из этого следует, что липиды играют множество ролей в организме (правда, структурные свойства мембран определяются, видимо, основными тремя-четырьмя компонентами, если не считать белки).

Во-вторых, распределение липидов и белков в плоскости мембраны неоднородно и характеризуется определенной структурой — латеральной гетерогенностью. Такая организация свойственна и сравнительно простым (например, трехкомпонентным) смесям липидов, которые используют в качестве моделей биомембран: в пределах единой жидкокристаллической фазы появляются микрофазы, не смешивающиеся между собой. В мембранах клеток подобная самоорганизация обеспечивает сортировку мембранных белков в различные компартменты в пределах одной и той же поверхности, повышая эффективность взаимодействия белков между собой.

И, в-третьих, функциональное состояние мембраны неустойчиво: может быть стационарным (когда концентрации разных липидов сохраняются примерно на том же уровне), но обязательно включает непрерывный обмен веществом (регенерация и «отпочковывание» участков мембраны).

В практическом смысле вышеперечисленное означает, что липиды, будучи жидкими, способны образовывать частично изолированные области бислоя, обладающие особыми структурными свойствами. Эти участки представляют собой кластеры («островки») молекул липидов, сравнительно более упорядоченные и «твердые», чем окружающая их более «жидкая» фаза. В конце 1990-х такие кластеры получили уже упомянутое название рафтов [8], и то же самое название было дано новой теории организации биологических мембран.

Сосуществование двух жидких липидных фаз — относительно более и менее упорядоченное — оказывается возможным, если смесь содержит как минимум три разновидности липидов: «легкоплавкие» (с низкой температурой плавления и ненасыщенными «хвостами»), «тугоплавкие» (у которых температура плавления выше физиологической, насыщенные хвосты и/или высокая склонность образовывать водородные связи с соседями), а также холестерол (рис.3). «Тугоплавких» липидов в эукариотической мембране немного, в основном — сфингомиелин (производное церамида). Молекулы холестерола, по всей видимости, играют роль центров кристаллизации для доменов из «тугоплавких» липидов, однако его присутствие в то же время не позволяет им образовать твердую (гелевую) фазу. Чтобы лучше представить возможные фазовые состояния в мембране и в сложных липидных смесях, ее имитирующих, разъясним основные понятия.
состояние липидов Рис.3. «Жидкое упорядоченное» состояние липидов в модельных мембранах [18]. Слева — фазовая диаграмма тройной смеси холестерола (Хол), сфингомиелина (СМ) и пальмитоилолеилфосфатидилхолина (ПОФХ). Цветные области соответствуют составам, при которых мембрана пребывает в жидком состоянии. Сосуществование жидкой упорядоченной (Lo) и жидкой неупорядоченной (Ld) фаз показано синим цветом: здесь при увеличении концентрации холестерола в диапазоне 10—35% размеры доменов Lo-фазы постепенно увеличиваются. В центре — микрофотографии гигантских везикул, состоящих из насыщенного (ДПФХ) и ненасыщенного (ДОФХ) фосфолипидов, а также холестерола. Образующиеся в везикулах макроскопические мембранные домены окрашиваются флуоресцентными красителями, «предпочитающими» упорядоченную (оранжевый цвет) или неупорядоченную (зеленый) фазу. При увеличении концентрации (χ) холестерола сверх 16% макроскопические домены уже не видны, но разделение Lo/Ld продолжает существовать, о чем говорит низкий сигнал флуоресцентро-резонансного переноса энергии (FRET) между молекулами красителя разных типов, находящихся в разных доменах (примерное положение двух верхних микрофотографий везикул обозначено справа желтым кругом).

Твердую фазу, или гель (So, от англ. solid ordered), проще всего представить, вспомнив маргарин. Для нее характерно высокоупорядоченное состояние липидных «хвостов», приблизительно параллельных друг другу. Толщина бислоя, состоящего из липидов в этой фазе, будет максимальной, а площадь молекулы — минимальной.

Жидкая, или жидкокристаллическая, фаза (L, от англ. liquid) в биологических мембранах и сложных смесях существует в двух разных (и взаимно несмешивающихся) видах: упорядоченном (Lo, от англ. liquid ordered) и неупорядоченном (Ld, от англ. liquid disordered). Lo-фазу, с одной стороны, можно считать синонимом рафтов и липидных доменов в мембране, поскольку она отличается довольно высокой упорядоченностью липидных «хвостов», а значит и большей толщиной состоящих из нее липидных доменов; с другой стороны, это мезофаза, так как она обладает высокой латеральной подвижностью (за счет малого размера рафтов в мембране), что помещает ее примерно посередине между жидкостью и твердой фазой. Ld-фаза — это настоящая, свободно перемешивающаяся, жидкость, только в двух измерениях. Липидные «хвосты» в этой фазе максимально неупорядоченны. Проще всего жидкую фазу Ld представить, посмотрев на масляное пятно, на поверхности которого переливаются радужные узоры.

Равновесие между Lo- и Ld-фазами было давно найдено в искусственных мембраноподобных системах — например, гигантских везикулах, изготовленных из липидов легочного сурфактанта (см. рис.3,б). Однако наблюдать такое разделение непосредственно в биологической мембране долгое время не удавалось. Но ведь липидный состав искусственных мембран был подобран максимально похожим на мембраны настоящие — так в чем же дело?

Проблема заключается в том, что в биологических мембранах Lo-фаза сильно раздроблена — максимальный размер рафтов не превышает 100 нм, а это недоступно для непосредственного наблюдения в оптический микроскоп. Причины, не позволяющие рафтам в живой клетке сливаться в крупные домены, видимые в оптический микроскоп (а именно это и происходит в искусственных мембранах), мы обсудим чуть позже.

НА МАЛЕНЬКОМ ЛИПИДНОМ ПЛОТУ

Гипотеза рафтов возникла, когда увидели, что гликосфинголипиды перед тем, как направиться к полюсам поляризованных эпителиальных клеток, не равномерно распределяются в комплексе Гольджи, а кластеризуются вместе. Затем оказалось, что эти кластеры прочнее и устойчивее «обычных» участков мембран (не растворяются в детергенте «тритон X-100») и состоят преимущественно из холестерола и сфингомиелина, а кроме того, в эти кластеры неизменно попадают белки — гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ)-заякоренные белки. Логично было предположить, что эти плотные кластеры образуют стабильные «плоты» (размером примерно 50 нм), в которые встроены определенные типы белков. Подтверждением тому стали исследования, в которых синтетические мембраны, содержащие холестерол и гликосфинголипиды, проявили примерно те же свойства: липиды, разделяющиеся на две несмешивающиеся фазы, даже можно было разглядеть в микроскоп (рис.3,б).
Рафтовые неоднородности Рис.4. Рафтовые неоднородности в мембране различного масштаба [9]. Вверху — нанокластеры холестерола, сфингомиелина, гликосфинголипидов и белков плазматической мембраны различаются по составу. Считается, что в эти кластеры входят ГФИ-заякоренные белки, трансмембранные (ТМ) белки, специфичные для рафтов, и цитоплазматические белки, связанные с актиновыми филаментами. «Обычные» ТМ-белки не входят в состав рафтов. В середине — в ответ на внешние сигналы нанокластеры могут сливаться с образованием рафтовой платформы, важной для ТМ-передачи сигналов и мембранного транспорта. Внизу — рафтовая фаза, видимая в микроскоп (диаметр ≈1 мкм), наблюдается исключительно в равновесных мембранных системах, таких как гигантские синтетические или мембранные везикулы. В «нативных» мембранах постоянный обмен веществом и энергией «дробит» рафтовую фазу до субдифракционных размеров.

Однако с течением времени стало понятно, что такое представление — противоположная крайность по сравнению с жидкостно-мозаичной моделью Сингера—Николсона: рафты далеко не столь стабильны, как это было постулировано первоначально. Вероятно, это динамические структуры, постоянно обменивающиеся молекулами липидов и белков с остальной частью мембраны; при этом липиды в рафтах упакованы гораздо более плотно и структурированно, нежели в окружающей «жидкой» мембране. Современное определение рафтов звучит так: «Мембранные рафты — это маленькие (10—200 нм), гетерогенные и очень динамичные липидные кластеры (или домены), обогащенные холестеролом и сфинголипидами и принимающие участие в клеточной компартментализации. В некоторых случаях рафты могут стабилизироваться за счет белок-белковых и белок-липидных взаимодействий, формируя более крупные “рафтовые платформы”» (рис.4) [9].

Однако, несмотря на то, что определение рафтам дано, само их существование представлялось до недавнего времени довольно-таки спорным, т.е. не подтвержденным в прямом эксперименте. Как же понимать этот парадокс?

Непосредственное изучение рафтов затруднено тем, что их очень сложно наблюдать «напрямую» из-за малого размера: типичный их предполагаемый диаметр меньше дифракционного предела оптической микроскопии (≈200 нм). Правда, в последние годы уже появились экспериментальные методики непосредственного наблюдения рафтовых кластеров. В частности, одна из разновидностей оптической микроскопии сверхвысокого разрешения — наноскопия индуцировано истощенного излучения — позволила установить, что ГФИ-заякоренные белки в течение достаточно длительного времени (10—20 мс) захватываются в сфинголипидно-холестерольные домены размером <20 нм в мембранах живых клеток, т.е. в рафты (рис.5) [10].

Но даже с помощью этих точнейших наблюдений невозможно проникнуть в детали межмолекулярных взаимодействий, заставляющих липиды собираться в кластеры, а также «захватывать» с собой белки. Такую информацию могут дать методы компьютерного моделирования (in silico).

КЛАСТЕРИЗАЦИЯ ЛИПИДОВ IN SILICO

Современные методы молекулярного моделирования позволяют изучить процесс самоорганизации липидных смесей с разной степенью детализации. Расчеты молекулярной динамики (МД) модельных мембран (подробнее см.: Чугунов А.О., Ефремов Р.Г. Компьютерные игры в молекулярную биофизику // Природа. 2010. №12. С.36—43), в которых все атомы липидов и окружающего растворителя представлены в явном виде, дают наиболее полную информацию. И хотя при таком подробном рассмотрении системы, доступные для моделирования даже на современных суперкомпьютерах, ограничены в своих размерах (102—103 молекул липида) и длительности наблюдения за их динамическим поведением (<10 -6 c), получаемые результаты дают атомарную картину возникновения мембранных неоднородностей в наномаштабе. Даже в случае однокомпонентной липидной мембраны ее поверхность не является однородно полярной, как это можно было бы предположить из схематического представления липидов в виде «шариков с хвостиками»; часть этих «хвостиков» всплывает на границу вода—мембрана и формирует гидрофобные участки (рис.6). В итоге мы имеем мозаично организованную поверхность, на которой в полярном «море» рассредоточены гидрофобные «островки» размером до нескольких квадратных нанометров [11].
МикроскопияМикроскопияРис.5. Преимущества микроскопии подавления индуцированного излучения (STED) в сравнении с конфокальной (а) [10]. STED-микроскопия — инновационный способ наблюдения липидной динамики мембран позволяет «заглянуть» за дифракционный барьер (т.е. различать объекты <200 нм). Образование Lo-фазы связано с формированием доменов, обогащенных холестеролом и сфингомиелином, что можно установить при помощи FRET-метода. Однако размер зоны, в пределах которой обычный конфокальный микроскоп позволяет различать детали (≈250 нм), оказывается слишком велик, чтобы точно определить, движутся ли две молекулы совместно (т.е. образуют домен) или независимо. STED-микроскопия с размером «зоны наблюдения» всего 50 нм позволила установить существование холестерольно-сфингомиелиновых доменов на живых клетках, положив конец спору о существовании рафтов в живых клетках. Принцип STED-микроскопии сходен с конфокальной микроскопией, но в этом случае кроме возбуждающего лазерного импульса (б, слева), запускающего свечение молекул-флуорофоров, используется также кольцевой формы гасящий импульс (б, в центре), уменьшающий эффективный радиус зоны возбуждения флуорофоров до ≈50 нм (б, справа), что в 4–5 раз меньше пресловутого «дифракционного барьера».

При смешивании двух компонентов, например насыщенного (дипальмитоил) и ненасыщенного (диолеил-) фосфатидилхолинов (ДПФХ и ДОФХ соответственно), картина усложняется — наблюдается обособление более «твердой» фазы (ДПФХ) в стабильные нанокластеры, равномерно распределенные в плоскости мембраны [12]. При моделировании трехкомпонентных мембран, в состав которых входят холестерол, сфингомиеин и ДОФХ, даже на небольших временах МД (2*10-7 с) наблюдается настоящее фазовое разделение, при котором «тугоплавкий» сфингомиелин формирует островок, по границе которого располагается холестерол, обращенный своей «щетинистой» стороной во внешнюю фазу «легкоплавкого» ДОФХ [13].
Мозаичная организация Рис.6. Мозаичная организация поверхности простейшей однокомпонентной мембраны. Вверху представлена идеальная модель мембраны, внизу — поверхность полноатомной мембраны (ДОФС), раскрашенной по гидрофобности.

Увеличить размер моделей, а также время наблюдения за многокомпонентными мембранами in silico позволяет упрощенное («крупнозернистое») описание молекул (когда группы из трех-четырех атомов для ускорения расчетов объединяют в «зерна»). Такая методика позволила впервые «увидеть» разделение Lo/Ld-фаз в мембране из нескольких тысяч молекул, содержащей 40% насыщенного ДПФХ, 30% ненасыщенного дилинолеилфосфатидилхолина (ДЛФХ) и 30% холестерола, моделируемых в течение 20 мкс [14]. Более того, если к такой модельной мембране добавить трансмембранные спиральные пептиды (минимальные «строительные блоки» большинства мембранных белков), можно будет наблюдать, как происходит их сортировка между фазами — моделируемые фрагменты белка предпочитают находиться в более жидкой Ld-фазе ДЛФХ и избегают упорядоченной Lo-фазы ДПФХ (рис.7) [15].
локализация трансмембранных пептидов Рис.7. Предпочтительная локализация трансмембранных пептидов WALP23 (выделено желтым) в Ld-фазе. Модельная мембрана состоит из липидов ДЛФХ, ДПФХ (показано красным и зеленым, соответственно) и холестерола (серые вкрапления круглой формы).

Стоит отметить, что возникновение латеральной гетерогенной структуры в мембране наблюдается при смешивании не только «тугоплавких» и «легкоплавких» липидов, но и любых других, отличающихся по своим физико-химическим свойствам (например, по заряду полярной головки и склонности образовывать водородные связи с соседями). В частности, в модельной бактериальной мембране, содержащей 70% фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и 30% отрицательно зараженного фосфатидилглицерола (ФГ) также формируются нанодомены. Происходит это за счет того, что молекулы ФЭ эффективно взаимодействуют друг с другом и вытесняют «невыгодного» партнера ФГ. Использование «крупнозернистых» моделей позволило установить, что такая латеральная организация мембран бактерий участвует в процессе связывания антимикробных пептидов, которые при этом вызывают рост доменов ФГ и возникновение фазового разделения [16].

ЧТО ОГРАНИЧИВАЕТ РАЗМЕР РАФТОВ В БИОМЕМБРАНАХ

В реальных экспериментальных системах существует достаточно парадоксальный контраст с искусственными мембранами, в которых разделение фаз Lo/Ld наблюдали неоднократно и при разных условиях. В живой клетке это удалось сделать непосредственно лишь недавно, да и то с использованием самых современных технологий субдифракционного наблюдения [10]. В чем же причина такого разительного отличия?

На границе рафтовой фазы создается поверхностное (линейное) натяжение, а значит, там присутствует избыточная свободная энергия, снизить которую можно путем слияния отдельных «плотиков» в одну большую макрофазу. Примерно то же самое наблюдается в супе, на поверхности которого мелкие капли жира постепенно объединяются в более крупные пятна. Фактически то же самое происходит и в искусственных мембранах (например, в мембранных везикулах): самопроизвольный термодинамический процесс толкает к глобальному разделению Lo- и Ld-фаз. Но это означает, что отсутствие в живой клетке крупных Lo-кластеров — следствие активных процессов, протекающих с затратой энергии. (Возвращаясь к аналогии с супом — мы никогда не увидим одного большого пятна жира в кипящей кастрюле.) С одной стороны, это может происходить «само», поскольку мембрана, как и сама жизнь, — система, далекая от термодинамического равновесия. С другой — эволюция физико-химических свойств мембраны могла направленно выработать такое приспособление, поскольку оно позволяет мембранам выполнять свои функции более эффективно.

Так или иначе, в мембранах протекает ряд процессов, постоянно «дробящих» рафты, — именно поэтому их так долго и не могли с достаточной степенью уверенности «нащупать». Это постоянный обмен веществом и энергией, ведь мембраны представляют собой открытые системы: помимо многочисленных разновидностей везикулярного транспорта отдельные фрагменты мембраны выполняют и другую работу — «заглатываются» внутрь клетки и после какой-то переработки возвращаются обратно.
Динамическая модель рафтовРис.8. Динамическая модель рафтов. Домены Lo-фазы в мембране гетерогенны как по размеру, так и по времени существования (0.1 мс–1 с, показано цветом): это зависит от размера, липидного состава и «захваченных» белков, способных стабилизировать рафт. Длина пунктирных стрелок, изображающих латеральную подвижность доменов, пропорциональна времени жизни (a — i). Рафтовые платформы в биомембранах, хотя и выполняют важные функции, являются динамическими структурами, постоянно возникающими и пропадающими вновь.

Анализ огромного массива биохимических и биофизических данных, накопившихся за последние 15 лет, привел ученых к выводу, что состав липидного матрикса мембран эволюционно подобран так, чтобы при физиологических условиях всегда находиться вблизи фазового перехода (рис.8). Это способствует образованию в мембранах рафтов. Какова же их роль?

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ НАНОРАЗМЕРНЫХ НЕОДНОРОДНОСТЕЙ В МЕМБРАНЕ

Роль такого сложного фазового поведения липидного матрикса мембран еще только предстоит понять в полной мере. Впрочем, уже сегодня ясно главное — такие свойства позволяют группировать (сортировать) разные белки в частично изолированные области, что дает им возможность выполнять свои функции. Эти свойства определяют и то, как мембранам делиться и сливаться, что важно и для деления самих клеток, и для везикулярного транспорта, и для проникновения внутрь клеток вирусов, токсинов и т.д. Приведем лишь несколько примеров [17].

Передача сигналов при дифференциации Т-лимфоцитов. В основе приобретенного иммунитета лежит процесс «обучения» Т-лимфоцитов распознавать определенные антигены и уничтожать их, при этом «учителями» становятся антиген-презентирующие клетки (АПК). «Обучение» Т-лимфоцитов происходит в непосредственном контакте с АПК с образованием иммунологического синапса. Оказывается, рецепторы Т-клеток, входящие в этот синапс, кластеризуются именно в рафтовой фазе. Если эта фаза образовываться не будет (например, в лабораторном эксперименте из мембран исключат холестерол), то никакого «обучения» не будет и иммунитет не сформируется.

«Почкование» вирусных частиц. Многие вирусы, покидая зараженную ранее клетку, облачаются в липидную оболочку — часть мембраны клетки-хозяина. Некоторые из них, в частности ВИЧ и вирус гриппа, «отпочковываются» от рафтовых участков мембраны, что приводит к тому, что вокруг их собственного нуклеокапсида образуется липидная «скорлупа», состоящая целиком из рафтовых липидов. Делается это, видимо, затем, чтобы в оболочку попали вирусные гликопротеины и не попадали ненужные вирусу мембранные белки клетки-хозяина.

Участие рафтов в мембранном транспорте. Выработка секретируемых белков и доставка мембранных начинаются с эндоплазматического ретикулума (ЭР) с «промежуточной остановкой» в комплексе Гольджи. В этом транспорте на основе все тех же принципов разделения фаз в липидных системах играет роль жидкая упорядоченная фаза (рафты). Установлено, что существует три различных пути выхода везикул с белковым «грузом» из ЭР: два из них отвечают за транспорт растворимых белков, а третий служит «портом отправления» ГФИ-заякоренных белков, расположенных внутри рафтов в мембране клетки. Так вот, уже на стадии ЭР эти белки транспортируются в везикулах, близких по составу рафтам (насыщенных холестеролом и церамидами).

Некоторые рафтовые липиды — «троянские кони» для бактериальных токсинов и вирусов. В частности, шигатоксин (токсин бактерий, вызывающих дизентерию) и холерный токсин, формируя пентамерный «бублик», захватывают рафтовые гликосфинголипиды — ганглиозиды Gb3 и GM1, что провоцирует образование «впячиваний» мембраны в виде трубочек, а это и лежит в основе токсического действия этих микроорганизмов.

* * *

Кажущаяся простота липидного «океана» осталась в прошлом, но и сейчас исследователи лишь приблизительно представляют все молекулярные тонкости образования кластеров в липидах. Точно так же далек от понимания и механизм «сортировки» одних белков в рафтовую фазу, а других — в более жидкую область мембраны. Между тем это понимание дало бы возможность создать стратегию рафт-селективной доставки в клетку различных веществ, в том числе лекарств. Все рассказанное в этой статье относится в первую очередь к мембранам эукариот, но это еще не означает, что у бактерий нет ничего подобного (раз нет и холестерола). Изучение латеральной неоднородности бактериальных мембран может привести к созданию новых антибиотиков, избирательно уничтожающих патогенные микроорганизмы и свободных от проклятия резистентности, давно уже нависшего над «традиционными» антибактериальными средствами. История с изучением липидного матрикса мембран в очередной раз показывает, что живая материя устроена значительно сложнее, чем представлялось ранее, и изобретение новых высокоточных методик наблюдения лишь подчеркивает эту сложность.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Проекты 07-04-01514-а, 10-04-01217-а и 11-04-01606-а.

Литература

1. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. №175. P.720—731.
2. Bagatolli L.A., Ipsen J.H., Simonsen A.C. et al. An outlook on organization of lipids in membranes: searching for a realistic connection with the organization of biological membranes // Prog. Lipid. Res. 2010. №49. P.378—389.
3. Meer G.van, Voelker D.R., Feigenson G.W. Membrane lipids: where they are and how they behave // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2008. №9. P.112—124.
4. Cavalier-Smith T. Predation and eukaryote cell origins: a coevolutionary perspective // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2009. №41. P.307—322.
5. Itoh Y.H., Sugai A., Uda I., Itoh T. The evolution of lipids // Adv. Space Res. 2001. №28. P.719—724.
6. Gotoh M., Sugawara A., Akiyoshi K. et al. Possible molecular evolution of biomembranes: from single-chain to double-chain lipids // Chem. Biodivers. 2007. №4. P.837—848.
7. Piomelli D., Astarita G., Rapaka R. A neuroscientist’s guide to lipidomics // Nat. Rev. Neurosci. 2007. №8. P.743—754.
8. Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes // Nature. 1997. №387. P.569—572.
9. Jacobson K., Mouritsen O.G., Anderson R.G. Lipid rafts: at a crossroad between cell biology and physics // Nat. Cell Biol. 2007. №9. P.7—14.
10. Eggeling C., Ringemann C., Medda R. et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell // Nature. 2009. №457. P.1159—1162.
11. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Adaptation of a membrane-active peptide to heterogeneous environment. II. The role of mosaic nature of the membrane surface // J. Phys. Chem. 2009. B.113. P.1120—1126.
12. Pyrkova D.V., Tarasova N.K., Pyrkov T.V. et al. Atomic_scale lateral heterogeneity and dynamics of two-component lipid bilayers composed of saturated and unsaturated phosphatidylcholines // Soft Matter. 2011. №7. P.2569—2579.
13. Pandit S.A., Jakobsson E., Scott H.L. Simulation of the early stages of nano_domain formation in mixed bilayers of sphingomyelin, cholesterol, and dioleylphosphatidylcholine // Biophys. J. 2004. №87. P.3312—3322.
14. Risselada H.J., Marrink S.J. The molecular face of lipid rafts in model membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. №105. P.17367—17372.
15. Domanski J., Marrink S.J., Schäfer L.V. Transmembrane helices can induce domain formation in crowded model membranes // Biochim. Biophys. Acta. 2011. doi:10.1016/j.bbamem.2011.08.021.
16. Polyansky A.A., Ramaswamy R., Volynsky P.E. et al. Antimicrobial Peptides Induce Growth of Phosphatidylglycerol Domains in a Model Bacterial Membrane // J. Phys. Chem. Lett. 2010. №1. P.3108—3111.
17. Simons K., Gerl M.J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. №11. P.688—699.
18. Hancock J.F. Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. №7. P.456—462.